在miRNA的研究中，验证miRNA与基因靶向关系是一个关键步骤。miRNA通过其种子序列（即5’端第2-8个碱基）靶向结合mRNA的3'UTR区域，这一结合能够诱导细胞内的沉默复合体介导的mRNA降解或抑制mRNA的翻译过程。基于这一机制，可以通过将目的基因的3'UTR区域（或结合位点下游500bp）插入到荧光素酶报告基因载体luciferase的下游，与miRNA模拟物（miRNA mimics）共同转染目标细胞，加入底物后检测荧光素酶活性的变化。如果观察到荧光素酶活性的显著下调，说明该miRNA与靶基因的3'UTR区域存在相互作用。

目前常用的载体包括PGL3-CMV-LUC-MCS。双荧光素酶报告基因检测使用这一方法来验证miRNA与靶基因3'UTR之间的相互作用，主要包含以下几个步骤：

1. 靶基因的生物信息学预测： 通过生物信息学分析软件（如TargetScan、StarBase和miRanda等）分析特定靶基因的3'UTR区域序列是否存在miRNA结合位点。
2. 插入目标序列：将预测能够与miRNA结合的靶基因3'UTR序列插入到荧光素酶（Firefly luciferase）的3'UTR中。当miRNA与插入的序列结合后，将会抑制荧光素酶的翻译，导致最终的荧光值降低。
3. 相互作用的结构验证：通过实验步骤的执行，进一步分析结果。

通过上述步骤，双荧光素酶报告基因检测能够有效验证miRNA与靶基因3'UTR的相互作用，为研究miRNA的功能和调控网络提供了重要工具。

在使用尊龙凯时的双荧光素酶报告基因检测服务时，实验流程通常包括以下详细步骤：

材料与准备

• 细胞：HEK293细胞或目标细胞
• 转染试剂：推荐使用HieffTrans®invitrosiRNA/miRNATransfection Reagent
• 报告基因检测试剂：Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit
• 仪器耗材：酶标仪、细胞培养板等

实验步骤

1. 确认目标细胞质粒瞬转效率，理想情况下，应达到40%以上。
2. 将处于良好生长状态的细胞消化，并将其转移至24孔培养板中，培养至细胞覆盖率达到70%左右。
3. 进行转染操作，并在转染48小时后收集细胞样品。
4. 对细胞样品进行处理，提取裂解物后准备进行荧光检测。
5. 根据报告基因检测试剂盒的说明书，进行相应检测，包括准备Renilla Luciferase Assay工作液，并按照规定参数进行荧光素酶的检测。

常规检测分组可设置为：

• mimics NC + 对照质粒 + 海肾内参（TK）
• mimics NC + 3’UTR野生型质粒 + 海肾内参（TK）
• mimics NC + 3’UTR突变型质粒 + 海肾内参（TK）
• mimics + 对照质粒 + 海肾内参（TK）
• mimics + 3’UTR野生型质粒（WT） + 海肾内参（TK）
• mimics + 3’UTR突变型质粒（MT） + 海肾内参（TK）

通过尊龙凯时提供的双荧光素酶报告基因检测服务，能够加速基础研究及药物筛选的进程。

相关产品清单

• 双荧光素酶报告基因检测试剂： Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit (货号：11402ES)
• 转染试剂： HieffTrans® Liposomal Transfection Reagent (货号：40802ES)
• 其他相关试剂： HieffTrans® invitrosiRNA/miRNA Transfection Reagent (货号：40806ES)