冻存原理

当细胞的温度降至0°C以下时，细胞会经历脱水过程，导致细胞内可溶性物质浓度的增加，并在细胞内部形成冰晶。冰晶的大小对细胞造成的影响各不相同，大冰晶容易损伤细胞膜和细胞器，导致复苏后的细胞存活率和状态与冻存前显著不同。为了提高细胞的冻存效果，我们在冻存时采取以下两项措施：一是加入低温保护剂，二是缓慢冻存细胞。

冻存时机

细胞应在生长良好、密度约为80-90％、数量通常在106-107/ml时进行冻存。活力较差的细胞在冻存后的存活率往往极低。

低温保护剂

常用的低温保护剂为二甲基亚砜（DMSO），这是一种渗透保护剂，能够迅速进入细胞，提升细胞膜的水分通透性，降低冰点，从而延缓冻结过程。DMSO能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，形成胞外冰晶，减少细胞内冰晶的形成，从而减轻冰晶对细胞的损伤。

慢冻细胞

在冻存过程中，我们可以使用程序性降温盒来缓慢降低细胞温度，避免形成较大的冰晶。如果没有专业的降温设备，可以将细胞依次放在4°C保存1小时，-20°C保存2小时，-80°C过夜，这样大多数细胞也能适应。

冻存液配置

冻存液应提前配制并置于室温中备用，以避免临时配置过程中产生的热量损害细胞（DMSO在与培养基混合时会释放热量）。常规冻存液的配比为培养基：血清：DMSO=7:2:1；如果细胞较为珍贵，可调整为血清：DMSO=9:1。

操作步骤

1. 使用移液器吸走原培养基，加入适量PBS洗涤1-2遍；
2. 消化细胞：加入适量胰酶，置于37°C培养箱中消化（在10厘米培养皿中加入1ml 0.25%的胰酶，消化4-5分钟，注意不同细胞的消化时间不同，终止消化的标准是镜下观察到80%-90%以上的细胞变圆）；
3. 待消化完成后，加入2倍体积的完全培养基以终止消化，随后以800-1000 rpm离心3-5分钟；
4. 准备冻存管，标记日期、细胞类别、操作者姓名和细胞代数；离心后去除上清液，加入冻存液重悬，每管1-1.5ml，转移至冻存管中；
5. 将冻存管放入程序降温盒中-80°C保存过夜，然后转移至液氮中保存。

注意事项

1. 细胞加入冻存液后，应立即放入-80°C保存，切勿在常温下放置过长时间；
2. 冻存细胞建议在-80°C中保存不超过半年，液氮中通常不建议超过2年。

凭借尊龙凯时的优秀技术支持，我们致力于优化细胞冻存过程，以确保细胞的最高存活率和功能性。